Схема голографічного мікроскопа ГДОГ. (A) Позаосьова голограма утворюється за допомогою інтерферометра Маха – Цендлера. (B) Демонстрація зразка, який випромінює ГДОГ і комбінується із даними від високошвидкісної камери. (C) Голограми відтворюються у цифровому вигляді, складаючи тривимірний відеоряд із двовимірної голограми. Copyright © PNAS

Порівняння ГДОГ-голографічних реконструкцій із тривимірними зображеннями, триманими на LSM. Усі зображення отримали зі зрізу скелетного м’яза мишіовщиною 50-мкм. (А) Голографічна реконструкція багатої на колаген з’єднувальної канини зі скелетного м’яза миші. (B) Тривимірне зображення від LSM тієї ж області канини. (C) Волюметричне накладення тривимірних зображень А і В (Шкала имірювання: 10 мкм.) Copyright © PNAS

  Від редакції:
Весь Всесвіт можна розглядати як одну велику голограму. Біологи та медики вже навчилися робити голографічні зображення живої тканини. Щоправда, наразі тренуються переважно на мишах.
У світі біомедицини панує оптична мікроскопія — і зокрема нелінійна оптична мікроскопія, яка використовує ультракороткі імпульсні лазери як джерело променів, що дозволяє дослідникам зазирнути набагато глибше у деталі біологічних зразків. Вже повідомлялося, що слабкі сторони даної технології сильно обмежують переваги тривимірних зображень.
Однак нещодавно дослідники з Університету штату Колорадо використали тривимірну генерацію другої оптичної гармоніки і тим збільшили швидкість кадрів, перевищивши у понад 8 000 разів поточну можливість нелінійної оптичної мікроскопії.
(У генерації другої оптичної гармоніки або ГДОГ фотони взаємодіють із нелінійним матеріалом, щоб утворити нові фотони з подвійною кількістю енергії і, відповідно, у два рази більшою частотою та половиною довжини хвилі. Якщо контраст у звичайних оптичних мікроскопах досягається визначенням зміни у оптичній щільності, довжині пройденого шляху або індексі відбивання від зразка, то мікроскоп ГДОГ визначає контраст через зміни у здатності зразка утворювати світло другої оптичної гармоніки від падаючого світла лазера.)
Більше того, дослідники ввели нові методи, які значно покращили обчислення якості сигналу відносно шуму. Дослідники зазначають, що завдяки їх роботі можна буде методом нелінійного оптичного зображення досліджувати поведінку, яку сучасні експериментальні методи не в змозі вловити — наприклад, динаміку нервового ланцюга.
Професор Ренді А. Бартелс (Randy A. Bartels) розказує про статтю яку він, а також Девід Р. Сміт (David R. Smith) та Девід Г. Вінтерс (David G. Winters) нещодавно опублікували у «ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences»: «Зараз створена нами конфігурація може робити безперервні зображення переважно зі швидкістю 10 мм/с для достатньо яскравих об’єктів»,— розповів Бартелс ресурсу Phys.org.
«Зазвичай найважче у даному випадку — це переконатися, що утворені гармоніки не зникнуть такій швидкості — і ми створили теорію для простого виконання обчислень таких умов, тож зазначена у статті конфігурація може записувати голограми об’єктів, які рухаються з такою швидкістю. Якщо взяти об’єкт, який рухається зі швидкістю 10 мм/с,— пояснює вчений,— то для інтеграції тривалістю в 1 мс (яку ми доволі легко можемо повторювати знову і знову), нам потрібно буде вловити зміщення об’єкту приблизно на 10 мікрон, що майже у двадцять разів перевищує сучасну роздільну здатність зображень». Залишається можливість формувати зображення швидше для достатньо яскравих об’єктів шляхом віддалення плану камери від плану об’єкта, додає він, при цьому об’єкт відбиває достатньо світла другої оптичнї гармоніки, щоб утворити гарну голограму — і хоча тут так само, як і для інших окремих об’єктів існує обмеження через гіперполяризацію існуючих гармонофор (молекул або частинок, які утворюють генерацію другої оптичної гармоніки), дослідники можуть збільшити яскравість завдяки коротшим імпульсам опромінення.
«Ми вже використовували ГДОГ для спостереження за ендогенними гармонофорами,— продовжує Бартелс,— а зараз дослідження ведуться за динамікою ряду процесів «наживо», наприклад, скороченням м’язів у ембріональних моделях і динамікою структуральних тканин, наприклад, сухожиль, в умовах деформацій високої швидкості». Команда також почала рухатися до отримання зображення потенціалу дії нейронів.
Головне завдання при спостереженні динаміки у живій тканині, каже Бартелс, точно таке ж, як і за потреби пришвидшити отримання зображень до 10 мм/с — тобто потрібне яскравіше розсіювання ГДОГ (що для даного зразка може бути збільшене лише зменшенням тривалості імпульсу опромінення) та оптимізація геометрії виявлення. «Хоча у дослідженні ми використовували створений у нашій лабораторії громіздкий твердотільний лазер з ітербію (Yb), здатний утворювати лазерні імпульси у 350 фемтосекунд, ми оснастили мікроскоп новим джерелом лазерного світла, що утворює імпульси у 80 фемтосекунд. Внаслідок цього сигнали і швидкість кінцевого зображення збільшаться у чотири рази. До того ж, важливо розташувати камеру якомога ближче до об’єкту,- зазначає вчений,- бо рухомий об’єкт не руйнує утворені гармоніки». Дана стаття може стати основою для створення оптимальної експериментальної установки.
Вчені також змогли дослідити когерентне розсіювання другого гармонічного світла від загального об’єму досліджуваного предмету.
«Ми побачили вигоди когерентного об’єму розсіювання, порівнявши зображення від ГДОГ-голографії та більш розповсюдженого лазерного сканування із голографією другої гармоніки, - зазначає Бартелс.- У таких структурах, як сегменти саркомеру в м’язових волокнах ми спостерегли значно яскравіші ГДОГ-сигнали від голографії, порівняно із лазерною скануючою ГДОГ-мікроскопією». Він додає, що на менш компактних об’єктах відмінності не такі помітні.
Зважаючи на зазначені вище завдання, Бартелс каже, що збільшена швидкість зображення вимагає від нас розуміння, як саме оптимізувати рівень відношення сигналу до шуму від ГДОГ-голограми і врівноважити цю оптимізацію із експериментальним дизайном, що попередить зникнення голографічних смужок під час швидкого руху досліджуваного об’єкту. «Ми розробили строгі показники для незалежної оцінки рівнів сигналу і шуму в голограмі і оптимізували швидкість зображення, чутливість та рівні шуму і сигналу, щоб отримати оптимальні технічні характеристики експериментальної системи». Результати вказують на поліпшення, які дослідники планують використати у системі наступного покоління.
Бартелс розповів ресурсу Phys.Org, що хоча лазерне сканування залишається стандартним підходом до отримання зображення із нелінійним оптичним контрастом, все одно через необхідність зчитувати промені для створення тривимірної картинки, покращення її якості має межі – а формування швидкого одновимірного або двовимірного динамічного зображення неможливе, так само як і неможливо прослідкувати за траєкторією руху у зразку. «Велика проблема у тому, що через рух у живому зразку виникають зміни, які порушують вимірювання і унеможливлюють запис поведінки на великій швидкості. З іншого боку, ГДОГ-голографія – нескануючий метод, який бере усю тривимірну інформацію одночасно для кожного кадру об’ємної картинки».
Бартелс додає, що окрім динаміки нейронних мереж, учені також прагнуть провести спостереження високошвидкісної динаміки м’язових скорочень та сполучних тканин, на які впливає напруга високої швидкості і подивитися, до яких змін і деформацій вони призводять.
«Сучасним технологіям отримання зображень бракує можливостей для спостереження за наслідками подібних травм на тканини, а також за напругою і розслабленням або ушкодженнями, які виникають через такі травми. ГДОГ-голографія дозволяє отримувати з таких тканин послідовність зображень у реальному часі для кращого розуміння властивостей тканини. Більше того, - продовжує думку вчений, - ГДОГ-голографія дозволяє отримувати такі динамічні зображення, які раніше були неможливими. Оскільки біологічні функції визначаються тривимірною організацією у тканинах, здатність вивчати високошвидкісну динаміку біологічних функцій – або відповідь біологічних систем і функцій на швидкий зовнішній стимул, збурення або травму – збільшить наші знання у біології і може вплинути на лікування травм».
Надалі, каже Бартелс, команда дослідників працюватиме над розробкою та введенням нових методів високошвидкісного тривимірного зображення на своїй ГДОГ-платформі – зокрема над можливостями флуоресцентного тривимірного зображення, що набагато складніше, оскільки флуоресцентне світле не має узгодженості, яку можна використовувати для високошвидкісного тривимірного зображення із ГДОГ. «Найперше, ми зацікавлені у вивченні швидкої динаміки у живих біологічних тканинах і системах і разом з іншими вченими шукаємо різні системи, які показують природні емісії ГДОГ. Крім того, ми розширюємо можливості мікроскопа для підсилення осьової роздільної здатності завдяки новим алгоритмам реконструкції голограми та модифікаціям дизайну мікроскопа». Мета дослідників – вивчати динаміку, яка була надто швидкою і перевищувала можливості звичайних мікроскопних приладів та краще розуміти, що саме є важливим у біологічних процесах.
«Окрім біологічного застосування, – підводить підсумок Бартелс, – я передбачаю також пропускну томографію вмісту крохмалю для дослідження або слідкування за виробництвом біопалива. Як альтернатива – можна слідкувати за кінетикою утворення і росту кристалів певних класів, включно із кристалами білків».